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酶標(biāo)ELISA試劑盒記抗體注意事項
更新時間:2016-10-24   點擊次數(shù):696次

 酶標(biāo)ELISA試劑盒記抗體注意事項

在ELISA試劑盒免疫酶技術(shù)中,首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因為酶標(biāo)記物濃度的很小變化,便可導(dǎo)致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外,由于濃度過高,可使非特異性反應(yīng)增加,而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此,正式試驗前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。

將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上,然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng),以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標(biāo)記抗體的效價,或稱工作濃度。

其步驟為:先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml,4℃隔夜,次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定),分別加入反應(yīng)孔中,每個稀釋度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應(yīng)。

結(jié)果判定主要以ELISA試劑盒比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標(biāo),結(jié)合物濃度為橫座標(biāo),繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右,且曲線斜率zui大時的酶標(biāo)抗體稀釋度,即為該標(biāo)記物的工作濃度。

有關(guān)試驗的試劑及器材均見ELISA試劑盒部分。

C要說明的是,本法為ELISA試劑盒直接法,所測的工作濃度與在實際應(yīng)用中的zui適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA試劑盒實驗系統(tǒng)中,因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)一步確定實際工作濃度(可采用方陣法),以達(dá)到zui適的實驗條件。

注意事項

1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下,所要標(biāo)記的抗體也要活性高,效價高(zui低1∶16),純度高,親和力好,這是保證標(biāo)記物效價高,免疫活性好的首要條件。"

2. 所使用ELISA試劑盒的PH和濃度及用量必須嚴(yán)格掌握。所用試劑,(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標(biāo)記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品,因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質(zhì))。否則,影響標(biāo)記效果。

3. 室溫攪拌時須避光,室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標(biāo)記物每次透析前,須認(rèn)真檢查,防止漏液。

4. 濃的標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定,常加入30~40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1~2年,但稀釋成1∶10,只能保存數(shù)周。ELISA試劑盒已配制的使用液應(yīng)在12小時內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。

 

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